ningxueqin 发表于 2024-3-12 09:58:33

全人源化抗体的优点:膜上一片空白怎么回事?

  本周小编给大家带来的是:WB实验结果——膜上一片空白,到底是什么原因导致的呢?一起来看看吧!
  一、胶和膜放反了:如果在转印的过程中,全人源化抗体的优点胶和膜的位置颠倒了,那么蛋白就从胶上转移到缓冲液中,而不会到达膜上。对于标准的转印,凝胶应靠近三明治的负极,而膜对应正极。
  二、转膜效率低:转膜效率受多种因素影响,包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说,蛋白越大,转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值,那么这个蛋白携带的电荷很少,在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的,那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。
  三、试剂放置太久或存放条件不正确:抗体会慢慢降解,如果反复冻融的话,它会快速降解。底物应储存在-20℃。
  四、抗体不纯或滴度太低:一抗的浓度差异很大,应该根据经验来决定一抗的稀释度。一般的原则是以1:100-1:1000来稀释血清或组织培养上清,以1:1000-1:10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1:3000。
  五、酶失活了:叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中,而无副作用。另外,只能使用蒸馏的去离子水。
  六、使用Tween-20洗涤:Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用,或洗去PVDF膜上的目的蛋白。因此除了封闭之后的第一次洗涤,其他洗涤过程中都不使用Tween-20。
  七、检测系统缺乏足够的灵敏度:确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内。
页: [1]
查看完整版本: 全人源化抗体的优点:膜上一片空白怎么回事?