慢病毒生产免疫沉淀常见问题解答

　　制备抗原样品 (细胞裂解物) 是 IP 的第一步，也是关键的一步。慢病毒生产正确的细胞裂解液可以稳定天然蛋白质构象、抑制酶活性、最大限度地减少抗体结合位点变性并释放细胞或组织中的蛋白质。一般可选 NP-40、RIPA、Western 及 IP 细胞裂解液等。抗原样品应始终保存在冰上，并将蛋白酶抑制剂 添加到裂解液中以防止蛋白水解。
　　注 1：Co-IP 实验时，常用 NP-40 等非离子型裂解液，以免破坏蛋白-蛋白相互作用。
　　注 2：确保目的蛋白在抗原样品中有较高水平表达。
　　图 2. 培养、收集、裂解细胞，释放靶蛋白
　　■ Step 2——样本结合
　　通过此步骤，您将获得磁珠—抗体—抗原样品复合物。磁珠、抗体、抗原样品的加样顺序对靶蛋白得率有一定影响。
　　图 3. 常见 IP 实验的样本结合步骤
　　All in one——直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起；
　　直接结合——抗体和磁珠先结合，再和抗原样品结合；
　　间接结合——抗体和抗原样品先结合，再和磁珠结合。
　　可选步骤 1——抗原样品预处理：为减少非特异性结合，可将抗原样品单独与 Protein A/G 磁珠或同型对照抗体结合。
　　(预处理有助于去除在 IP 过程中可能与抗体或磁珠非特异性结合的分子，从而改善信噪比。)
　　可选步骤 2——抗体的交联固定：如果不希望抗体与目标蛋白共洗脱，可在直接结合时，使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。后续使用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。
　　(直接将磁珠、抗体、抗原样品混合到一起，速度最快，但获得的靶蛋白纯度和得率会很低；间接结合靶蛋白得率最高，但在洗脱步骤时，抗体会和靶蛋白一起被洗脱；直接结合，蛋白得率也较高，且可通过交联固定抗体，达到单独洗脱靶蛋白的目的。)
　　一般情况下，如果靶蛋白丰度较高，直接结合与间接结合差别不大，均可选；如果靶蛋白丰度不高，可选间接结合以获得更高的靶蛋白得率。
　　样本结合步骤中的结合/洗涤缓冲液也非常重要。一般情况下，您的结合/洗涤缓冲液可以为同一种缓冲液，如 TBST/PBST。另外可通过加入去垢剂 (如 0.5-1% NP-40/TritonX-100/Tween-20)、增加盐离子浓度 (如 250 mM NaCl/1-2 mM DTT/β-ME)、增加洗涤次数等来提高洗杂效率。
　　■ Step 3——抗原洗脱
　　一般根据下游应用选择洗脱方法：
　　图 4. 常见抗原洗脱方法
　　1) 变性洗脱法：如果下游分析是用免疫印迹 (Western Blot)，则通常直接使用 SDS-PAGE Loading Buffer 进行洗脱 (95°C 加热 5 mins)。该缓冲液可使蛋白质变性还原并用于电泳，十分高效，适用于亲和作用的解离。但该方法也会洗脱下抗体等非靶分子，且获得的蛋白不具备生物活性。
　　2) 酸性洗脱法：0.1 M-0.15 M 甘氨酸 (pH 2.5-3) 是 IP 中最高效的非变性洗脱缓冲液，低 pH 水平可以解离大多数抗体-抗原相互作用。此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。但酸性洗脱不是万能方法，采用该缓冲液可能无法解离某些抗体—抗原相互作用，而且部分抗体对低 pH 环境敏感。
　　注 1：在洗脱前的接收管中提前加入中和液，可缓解抗体对于低 pH 环境的敏感。
　　注 2：低 pH 水平也可以解离未交联情况下的抗体&mdashrotein A/G 相互作用。如果不希望抗体与靶蛋白共洗脱，可在样本结合步骤时，使用交联剂将抗体共价连接到 Protein A/G 上。而后再用酸性洗脱法洗脱靶蛋白。
　　3) 竞争性洗脱法：如果靶蛋白带有标签，可用高浓度标签或配体进行竞争性洗脱。如 Flag 标签蛋白，可用 3×Flag peptide 竞争性洗脱，此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析，而且还没有抗体片段污染。