可编程靶向单分子测序技术助力遗传疾病精准基因诊断

　　迄今为止，已发现超过50种神经与神经肌肉疾病是由STR(short tandem repeats)扩增引起的，涉及37个不同的基因。STR具有高度多态性，并通过一系列不同的机制表现出致病性。本研究利用ONT的“ReadUntil”功能，对ONT测序设备进行编程，结果证明ONT ReadUntil可在单次测序中实现所有已知神经性疾病相关STR的精准鉴定，不涉及额外的实验室流程。该研究确立了可编程靶向ONT测序对STR扩增相关疾病基因诊断的分析有效性，靶向测序并展示了该方法的众多优势。

　　研究方法：

　　从患者血液样本中提取高分子量基因组DNA，使用Covaris将DNA剪切至15 -25 kb片段大小，基于ONT平台(R9.4.1)进行测序，通过Readfish软件包的ONT ReadUntil API实时执行目标区域选择/剔除。

　　主要研究结果：

　　(1) 可编程靶向Nanopore测序可行性评估

　　为了评估使用ReadUnti进行STR分析的可行性，本研究设计了一个自定义面板，其中包含所有已知与原发性神经和神经肌肉疾病有关的致病性STR扩增相关基因(n=37，图1 A)。对于每个基因，靶向整个基因座，包括两端的50 kb侧翼序列。该面板总共覆盖约50.5 Mb，相当于人类参考基因组(hg38)的1.6%。

　　图一 可编程靶向Nanopore测序

　　研究结果表明，与靶向区域(N50=12.5 Kb)相比，非靶区域(N=2.5 kb)的read长度一致减少，表明该方法成功剔除了靶向区域以外的片段(图1B)，使得靶向区域内覆盖率增加了9~40倍(图1C)。

　　接着作者评估了各种参数的影响，并确定了最佳的工作流程参数(LSK110、MinION-PC、>1200个孔)，在最佳流程参数下，获得了跨越目标STR位点序列排列的中位数(图1 D)，表明ONT ReadUntil可以实现有效的目标STR测序。