线性化质粒生产轻松掌握细胞凋亡检测实验的方法

　　线性化质粒生产细胞凋亡是一种细胞主动有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为了更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡。本期生物给大家介绍细胞凋亡检测实验的方法，一起来学习下吧！
　　一、PI 单染色法
　　1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106 个/mL｝，500 ~ 1000 r/min 离心 5min，弃去培养液。
　　2. 3ml PBS 洗涤 1 次。
　　3. 离心去 PBS，加入冰预冷的 70%的乙醇固定，4℃，1—2 小时。
　　4. 离心弃去固定液，3mlPBS 重悬 5min。
　　5. 400 目的筛网过滤 1 次，500—1000r/min 离心 5min，弃去 PBS。
　　6. 用 1ml PI 染液染色，4℃避光 30min。
　　7. 流式细胞仪检测：PI 用氩离子激发荧光，激光光波波长为 488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析 PI 荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
　　8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析 PI 荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在 PI 荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0 期前出现一亚二倍体峰。如以 G1/G0 期所在位置的荧光强度为 1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为 0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的 PI 荧光强度做参照标准，两者分别为 0.35 和 0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
　　注意事项：
　　细胞凋亡时，其 DNA 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 DNA 可染性降低也可能是因为 DNA 含量的降低，或者是因为 DNA 结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。
　　二、Annexin V/PI 双染色法
　　1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到 10ml 的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min 离心 5min，弃去培养液。
　　2. 用孵育缓冲液洗涤 1 次，500~1000r/min 离心 5min。
　　3. 用 100ul 的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育 10~15min。
　　4. 500~1000r/min 离心 5min 沉淀细胞孵育缓冲液洗 1 次。
　　5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液 4℃下孵育 20min，避光并不时振动。
　　6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用 488nm，用一波长为 515nm 的通带滤器检测 FITC 荧光，另一波长大于 560nm 的滤器检测 PI。
　　7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如 PI 有抗染性，坏死细胞则不能。
　　总结：细胞膜有损伤的细胞的 DNA 可被 PI 着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期 PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI- ）